Organisko molekulu vai vielu fosforilācijas līmeni nosaka ar divām metodēm: Western blot un masas spektrometriju. Fosforilēšana visbiežāk attiecas uz fosfāta piesaisti olbaltumvielām. Kad fosfāti saistās ar olbaltumvielām, tiek traucēti dabiskie proteīnu enzīmu procesi un funkcijas cilvēka organismā. Fosforilācijas līmeņa noteikšana ir ļoti svarīga, lai ārstētu dažādas slimības, sākot no vēža līdz diabētam.
Western blotēšana ir populāra metode, ko izmanto, lai noteiktu noteiktas olbaltumvielu kopas fosforilācijas līmeni. Antivielas, piemēram, anti-fosfotirozīna monoklonālās antivielas, parasti izmanto, jo tās viegli saistās ar proteīna tirozīna atlikumiem, kurus ietekmē fosforilēšana. Western blotēšanas laikā olbaltumvielas vispirms atdala pēc izmēra, izmantojot elektriskās lādiņa metodi, kas pazīstama kā gēla elektroforēze.
Pēc tam olbaltumvielas tiek pārnestas uz membrānu, kas ir pārklāta ar īpašām antivielām, kas saistās ar proteīnu fosfātiem. Kad olbaltumvielas ir pārnestas, antivielas pielīp pie jebkuriem proteīniem ar pievienotu fosfātu. Pēc tam fosforilācijas līmeni var noteikt ar membrānas rentgena staru. Jebkuri ietekmētie proteīni izdalīs gaismas zibspuldzi, padarot pētniekam vieglāku fosforilācijas līmeņa mērīšanu.
Masu spektrometrija ir vēl viens veids, kā izmērīt vielas fosforilācijas līmeni. Šis process pārvērš olbaltumvielu molekulas jonos, kas padara tās vieglāk izsekojamas un izmērāmas. Paraugu jonizē lieljaudas jonu avots, kas pārpludina paraugu ar elektroniem. Šī darbība pārvērš paraugu katjonos, pozitīvi lādētos jonos.
Masas spektrometra masas analizators atdala jonus pēc to masas un lādiņa intensitātes. Tas ļauj pētniekam atklāt masas un lādiņa attiecību, kas ir ļoti svarīga, lai atklātu parauga fosforilācijas līmeni. Visbeidzot, detektors mēra jonus tādā secībā, lai datus varētu parādīt diagrammas formā. Diagramma parāda jonu masas un lādiņa attiecību uz x ass un jonu relatīvo intensitāti uz y ass.
Fosforilācijas līmeni var izmērīt arī substrāta fosforilēšanas laikā. Substrāta fosforilēšana ir process, kas glikolīzes laikā rada adenozīna trifosfātu (ATP), molekulu, kas ir būtiska enerģijas pārnešanai starp šūnām. Šis process notiek gan dzīvnieku, gan augu šūnās.
Augu šūnās ATP molekulas tiek radītas, izmantojot saules enerģiju. Šī enerģija veicina fosforilēšanos auga hloroplastos, kas ir augu fotosintēzes vieta. Fosforilācijas līmenis korelē ar fosfāta daudzumu, kas nepieciešams, lai izveidotu papildu ATP molekulas.