Kas ir peptīdu attīrīšana?

Peptīdu attīrīšana tiek veikta, izmantojot hromatogrāfijas metodi, veidu, kā atdalīt savienojumus, kas atšķirīgi saistās ar fizisko matricu. Peptīdu attīrīšanai parasti izmanto augstspiediena šķidruma hromatogrāfiju (HPLC). Peptīdu vai peptīdus lieto šķīdinātāju maisījumā, kas laika gaitā mainās, kad tie tiek sūknēti pāri mazu lodīšu kolonnai ar augstu spiedienu. Dažādi peptīdi eluē dažādos laika punktos, un tos nosaka monitors, bieži vien UV spektrofotometrs.

Veicot pētījumus par peptīdiem, bieži vien interesējošā viela ir reta, un to nevar iegādāties no ķīmijas uzņēmumiem. Ja vēlamā peptīda struktūra ir zināma, bieži vien ir vieglāk ķīmiski sagatavot ar peptīdu sintēzi, nekā izolēt savienojumu no dabīgiem avotiem. Dabisko produktu izolācija ir ļoti sarežģīta. Sintētiskos peptīdus parasti attīra ar HPLC.

Šāda ķīmiskā sintēze var būt biedējoša neatkarīgam pētniekam, kurš nav ķīmiķis. Bieži vien šis uzdevums tiek slēgts ar peptīdu sintēzes uzņēmumiem, kas specializējas šajās tehnikās. Tas var būt ekonomiskāk nekā mēģināt izveidot sistēmu no nulles laboratorijā. Peptīdu uzņēmumi var izgatavot pielāgotus peptīdus, kas pielāgoti pētnieka vajadzībām.

Vēl viens peptīdu attīrīšanas iemesls var būt tad, kad pētnieks ir attīrījis proteīnu un mēģina noteikt tā identitāti. Viņš vai viņa var sadalīt proteīnu peptīdu fragmentos, atdalīt fragmentus ar attīrīšanu un noteikt peptīdu fragmentācijas modeli ar masas spektrometru, tiem eluējoties no kolonnas. Šī metode ir pazīstama kā LC-MS, saīsinājums no šķidruma hromatogrāfijas-masspektrometrijas. Tas norāda fragmentu molekulmasu un aminoskābju sastāvu, kā arī bieži vien ļauj identificēt proteīnus, ja iepriekš ir identificēti līdzīgi vai identiski.

Daudzi pētnieki strādā ar peptīdiem, kuriem ir jaunas īpašības, piemēram, nedabiskas aminoskābes, lai mēģinātu atrast tos ar neparastām bioloģiskām aktivitātēm. Ir vesela joma, ko sauc par peptidomimētiku, kas veltīta šādu jaunu peptīdu izpētei. Bieži vien tiek izstrādātas datorizētas sekvences, un tiek sintezēta peptīdu bibliotēka, kas ietver virkni netipisku peptīdu. Peptīdu attīrīšana tiek izmantota, lai atdalītu atsevišķus šīs bibliotēkas locekļus, lai nodrošinātu tīru peptīdu, lai pārbaudītu bioloģisko aktivitāti. Šī stratēģija ir bijusi veiksmīga, radot vismaz vienu jaunu komerciāli pieejamu medikamentu.

Daudzi no bioloģiski aktīvajiem peptīdiem ir interesanti izmantošanai medicīnā. Komerciāli izmantotie savienojumi, piemēram, insulīns, parasti tiek ražoti ar rekombinantās DNS pārmērīgas ekspresijas sistēmām, kas rada lielu daudzumu vēlamā savienojuma. Bieži vien peptīdi ir ģenētiski izstrādāti, lai atvieglotu attīrīšanu, to priekšpusē pievienojot kādu marķējumu. Tas ļauj izmantot afinitātes hromatogrāfiju, lai attīrītu peptīdu.

Izmantojot šāda veida hromatogrāfiju, marķējums ir savienojums, piemēram, histidīns, kas saistīs lodīšu matricu, piemēram, niķeli, kas izvēlēta pēc tās spējas saistīt tagu. Nevēlamie proteīni un peptīdi parasti iziet cauri kolonnai bez saistīšanās. Īpaši izstrādātais peptīds parasti stipri saistās ar kolonnu. Pēc tam, kad piesārņojošie proteīni un peptīdi ir nomazgāti, vēlamais peptīds tiek eluēts ar savienojumu, kas sacenšas par saistīšanos ar matricu. Pēc tam ir diezgan tīrs vēlamā peptīda preparāts, un marķējumu var noņemt, šķeldot.