Kas ir spektrofotometrs?

Gaismas enerģija ir atkarīga no tās viļņa garuma, ko parasti apzīmē kā lambda. Lai gan elektromagnētiskais spektrs sniedzas milzīgā viļņu garuma diapazonā, lielākā daļa laboratoriju var izmērīt tikai nelielu daļu no tiem. UV-Vis spektroskopija mēra no 200 līdz 400 nanometriem (nm) UV gaismas mērījumiem un līdz aptuveni 750 nm redzamajā spektrā.

UV-Vis spektroskopijai paraugus parasti satur un mēra mazos konteineros, ko sauc par kivetēm. Tie var būt plastmasas, ja tos izmanto redzamajā spektrā, bet tiem jābūt kvarcam vai kausētam silīcija dioksīdam, ja tos izmanto UV mērījumiem. Ir dažas iekārtas, kas var izmantot stikla mēģenes.

Redzamo spektroskopiju bieži izmanto rūpnieciski kolorimetrijā. Izmantojot šo metodi, paraugus mēra pie vairākiem viļņu garumiem no 400 līdz 700 nm, un to absorbcijas profilus salīdzina ar standartu. Šo paņēmienu bieži izmanto tekstilizstrādājumu un tintes ražotāji. Citi UV-Vis spektroskopijas komerciālie lietotāji ir kriminālistikas laboratorijas un printeri.

Bioloģiskajos un ķīmiskajos pētījumos šķīdumus bieži kvantitatīvi nosaka, mērot to gaismas absorbcijas pakāpi noteiktā viļņa garumā. Lai aprēķinātu savienojuma koncentrāciju, tiek izmantota vērtība, ko sauc par ekstinkcijas koeficientu. Piemēram, molekulārās bioloģijas laboratorijas izmanto spektrofotometrus, lai izmērītu DNS vai RNS paraugu koncentrāciju. Viņiem dažreiz ir uzlabota iekārta, ko sauc par NanoDrop™ spektrofotometru, kas izmanto daļu no parauga daudzuma, salīdzinot ar to, ko izmanto tradicionālie spektrofotometri.

Lai kvantitatīvā noteikšana būtu derīga, paraugam ir jāatbilst Bēra-Lamberta likumam. Tas prasa, lai absorbcija būtu tieši proporcionāla kivetes ceļa garumam un savienojuma absorbcijai. Ir pieejamas ekstinkcijas koeficientu tabulas daudziem, bet ne visiem savienojumiem.

Daudzas ķīmiskās un fermentatīvās reakcijas laika gaitā maina krāsu, un spektrofotometri ir ļoti noderīgi šo izmaiņu mērīšanai. Piemēram, polifenola oksidāzes enzīmi, kas izraisa augļu brūnināšanu, oksidē fenola savienojumu šķīdumus, mainot dzidrus šķīdumus pret tiem, kas ir redzami krāsoti. Šādas reakcijas var pārbaudīt, mērot absorbcijas pieaugumu, mainoties krāsai. Ideālā gadījumā izmaiņu ātrums būs lineārs, un no šiem datiem var aprēķināt likmes. Uzlabotākam spektrofotometram būs ar temperatūru kontrolēts kivetes turētājs, lai veiktu reakcijas precīzā temperatūrā, kas ir ideāli piemērota fermentam.

Mikrobioloģiskās un molekulārās bioloģijas laboratorijas bieži izmanto spektrofotometru, lai noteiktu baktēriju kultūru augšanu. DNS klonēšanas eksperimentus bieži veic ar baktērijām, un pētniekiem ir jāizmēra kultūras augšanas stadija, lai zinātu, kad jāveic noteiktas procedūras. Tie mēra absorbciju, kas ir pazīstama kā optiskais blīvums (OD), uz spektrofotometra. Pēc OD var pateikt, vai baktērijas aktīvi dalās vai sāk mirt.

Spektrofotometri izmanto gaismas avotu, lai caur monohromatoru spīdētu virkni viļņu garumu. Pēc tam šī ierīce pārraida šauru gaismas joslu, un spektrofotometrs salīdzina gaismas intensitāti, kas iet cauri paraugam, ar intensitāti, kas iet cauri atsauces savienojumam. Piemēram, ja savienojums ir izšķīdināts etanolā, atsauce būtu etanols. Rezultāts tiek parādīts kā starpības absorbcijas pakāpe starp tiem. Tas norāda parauga savienojuma absorbciju.

Šīs absorbcijas iemesls ir tas, ka gan ultravioletajai, gan redzamajai gaismai ir pietiekami daudz enerģijas, lai ierosinātu ķīmiskās vielas līdz lielākam enerģijas līmenim. Šī ierosme rada lielāku viļņa garumu, kas ir redzams, kad absorbcija ir attēlota pret viļņa garumu. Dažādas molekulas vai neorganiskie savienojumi absorbē enerģiju dažādos viļņu garumos. Tos, kuriem ir maksimāla uzsūkšanās redzamajā diapazonā, cilvēka acs uzskata par krāsotiem.

Savienojumu šķīdumi var būt dzidri, bet absorbēt UV diapazonā. Šādiem savienojumiem parasti ir dubultās saites vai aromātiskie gredzeni. Dažreiz ir viens vai vairāki nosakāmi maksimumi, kad absorbcijas pakāpi attēlo attiecībā pret viļņa garumu. Ja tā, tas var palīdzēt identificēt dažus savienojumus, salīdzinot diagrammas formu ar zināmo atsauces diagrammu formu.

Ir divu veidu UV-Vis spektrofotometru iekārtas, viena stara un dubultstaru. Tie atšķiras ar to, kā tie mēra gaismas intensitāti starp etalonparaugu un testa paraugu. Divstaru iekārtas mēra atskaites un testa savienojumu vienlaicīgi, savukārt viena stara iekārtas mēra pirms un pēc testa savienojuma pievienošanas.