Kas ir izoelektriskais punkts?

Aminoskābēm ir aminotermināla grupa, kas ir bāziska un ar augstu pH līmeni. Otrs aminoskābes gals ir karboksilgals, kas ir skābs ar zemu pH līmeni. Pie dažādām pH vērtībām proteīnu aminoskābju lādiņi atšķiras. Olbaltumvielām zem to izoelektriskā punkta ir pozitīvs lādiņš. Turpretim tiem, kas atrodas virs šī punkta, ir negatīvs lādiņš.

Lai izmantotu zināšanas par izoelektrisko punktu olbaltumvielu attīrīšanai, olbaltumvielu maisījums tiek pakļauts elektriskā lauka iedarbībai. To parasti veic agarozes vai poliakrilamīda gēlos, un to sauc par izoelektrisko fokusēšanu. Vecāks paņēmiens ir veikt procedūru lielākā mērogā stikla kolonnā, izmantojot saharozes šķīdumu ar elektrodiem katrā galā. Tiek pievienoti savienojumi, ko sauc par amfolitiem, kas izraisa konsekventa pH gradienta veidošanos. Kad želeja vai kolonna tiek pakļauta elektriskās strāvas iedarbībai, proteīni migrē, līdz sasniedz izoelektrisko punktu, un pēc tam paliek nekustīgi.

Proteīnus uz gēliem parasti padara redzamus ar krāsvielu, kas saista olbaltumvielas. Dažreiz, ja tiek pētīti fermenti, var izmantot substrātu, kas rada krāsainu reakciju. Parasti tiek izmantoti standarti, kuriem ir zināmi izoelektriskie punkti.

Kad ir zināms, kur atrodas vēlamais proteīns, izplatīts paņēmiens ir izgriezt izolēto proteīnu no želejas. Pēc tam proteīnu var attīrīt un sekvencēt. Kad secība ir zināma, to var izmantot, lai izstrādātu polimerāzes ķēdes reakcijas (pcr) primerus un izmantotu proteīna gēna klonēšanai, ja ir pieejams piemērots nukleīnskābes materiāls.

Izoelektriskā fokusēšana ir arī izplatīts veids, kā analizēt cieši saistītus proteīnus, lai redzētu, cik tie atšķiras viens no otra. Viena no komplikācijām var būt tā, ka olbaltumvielās var būt saistīti cukuri. To sauc par glikozilāciju un var ietekmēt proteīna pI. Var izskatīties, ka ir vairāki proteīni ar dažādiem izoelektriskiem punktiem, lai gan patiesībā ir tikai viens proteīns, kas ir diferencēti glikozilēts. Proteīnus, kas attīrīti ar standarta metodēm, piemēram, hromatogrāfiju, dažkārt analizē ar izoelektrisko fokusēšanu, lai nodrošinātu to tīrību.