Kas ir RNS kvantitatīva noteikšana?

Kad RNS tiek pakļauta ultravioletajai gaismai, tā selektīvi absorbēs šo gaismu pie viļņa garuma 260 nanometri (nm) un 280 nm. Šo metodi veic spektrofotometrā, kas rada ultravioletās gaismas viļņu garumus un mēra gaismu, kas iet cauri RNS. Lielāka RNS koncentrācija absorbēs vairāk gaismas.

Šo divu viļņu garumu kombinācija bieži tiek izmantota RNS kvantitatīvā noteikšanā, jo šī metode ļauj pētniekiem uzzināt, vai paraugs ir piesārņots ar citām makromolekulām, piemēram, olbaltumvielām. Šie piesārņotāji bieži selektīvi absorbē gaismu 280 nm, bet ne gaismu pie 260 nm. Rezultātā, aprēķinot absorbētās gaismas attiecību abos viļņu garumos, var noteikt piesārņojuma pakāpi.

RNS kvantitatīva noteikšana, izmantojot fluorescējošas krāsvielas, dod rezultātus, kas ir mazāk jutīgi pret dažiem piesārņotājiem, un to var izmantot ar zemu RNS līmeni, kas padarītu neiespējamu spektrofotometriju. Krāsvielas, piemēram, etīdija bromīds, saistās ar RNS, un iegūto spilgtumu var izmērīt tieši, izmantojot fluorescences fotometrus. Ja fotometrs nav pieejams, var sagatavot šķīdumus ar zināmu RNS koncentrāciju, un nezināmā parauga spilgtumu var aptuveni salīdzināt ar tiem. Attiecība starp spilgtumu un RNS koncentrāciju ir lineāra, tāpēc pētnieki var ātri noteikt koncentrācijas mērījumu no spilgtuma.

RNS kvantitatīva noteikšana, izmantojot jebkuru no metodēm, var būt ļoti jutīga pret dažādiem piesārņotājiem. Olbaltumvielas, fenols un lielas daļiņas var padarīt spektrofotometrijas rezultātus neprecīzus. Šie piesārņotāji neietekmē fluorescējošās krāsvielas RNS kvantitatīvo noteikšanu, taču šo metodi var padarīt neprecīzu, ja paraugā ir dezoksiribonukleīnskābe (DNS).

Krāsvielas, kas saistās ar nukleīnskābes, saistās gan ar DNS, gan RNS, un tām būs līdzīgs spilgtums, tāpēc ir svarīgi nodrošināt tīru RNS paraugu. Parastais veids, kā to paveikt, ir pievienot fermentu, kas iznīcina DNS, piemēram, DNSse, jauktam paraugam pirms krāsvielas pievienošanas. Atkarībā no RNS koncentrācijas paraugā un tajā esošajiem piesārņotājiem, laboratorijas var izmantot kādu no šīm metodēm, lai noteiktu RNS daudzumu.