Aleksandrs Flemings, skotu bakteriologs Londonā, penicilīnu atklāja kļūdas dēļ, kad viņš 1928. gadā mēģināja pētīt Staphylococcus baktērijas. Viņš veica eksperimentus ar baktērijām savā laboratorijā Londonas Sv. Marijas slimnīcā un nolika laboratorijas trauku, kurā atradās baktērijas. atvērts logs. Atgriežoties pie eksperimenta, viņš atklāja, ka pa atvērto logu uz trauka ieplūda pelējums, piesārņojot baktērijas.
Tā vietā, lai izmestu savu sabojāto eksperimentu, Flemings to rūpīgi aplūkoja savā mikroskopā. Pārsteidzoši, viņš redzēja ne tikai pelējumu, kas aug uz baktērijām, bet arī skaidru zonu ap pelējumu. Penicillium pelējums, penicilīna prekursors, izšķīdināja nāvējošās Staphylococcus baktērijas.
Flemings sākotnēji bija optimistisks, ka penicilīns būtu noderīgs kā antibakteriāls līdzeklis, jo tas ir drošs cilvēka ķermenim, tomēr iedarbīgs. Vēlāk, 1931. gadā, viņš mainīja savas domas un nolēma, ka tas nenotiks cilvēkiem tik ilgi, cik nepieciešams, lai iznīcinātu kaitīgās baktērijas, un pārtrauca to pētīt. 1934. gadā viņš sāka vēl dažus gadus ilgus klīniskos pētījumus un mēģināja atrast kādu citu, kas to attīrītu.
Pētnieki Oksfordas Universitātē Anglijā, tostarp Hovards Florijs, Ernsts Čeins un Normans Hītlijs, eksperimentēja ar Fleminga atklājumu. Viņi pierādīja, ka penicilīns būtu gan nekaitīgs, gan efektīvs pelēm, taču tam vēl nebija nepieciešamā apjoma cilvēku ārstēšanai. Orvans Hess un Džons Bumsteds bija pirmie cilvēki, kas to izmantoja, lai veiksmīgi ārstētu pacientu.
Otrajā pasaules karā penicilīns izglāba daudzu karavīru dzīvības, taču piedāvājums bija ārkārtīgi ierobežots, un zāles ātri izdalījās no organisma, tāpēc pacientiem bija jādod bieži. Šajā brīdī bija ierasta prakse glābt urīnu no pacientiem, kuri tiek ārstēti, lai penicilīnu varētu izolēt un izmantot atkārtoti. Galu galā tika atklāts, ka vēl viens līdzeklis, probenecīds, pagarina penicilīna darbības laiku cilvēka organismā.
Flemingam, Florejam un Čeinam 1945. gadā tika piešķirta Nobela prēmija medicīnā par penicilīna atklāšanu un izstrādi. Florejs bija atklāti noraizējies par iedzīvotāju eksplozijas iespējamību, ko izraisīs veselības aprūpes uzlabojumi, un sacīja, ka viņa darbs ar antibiotiku bija vairāk interesanta zinātniska problēma, nevis veids, kā palīdzēt cilvēkiem. Viņš atzina, ka tas, ka tas var palīdzēt cilvēkiem, bija laba lieta, bet ne iemesls, kāpēc viņš sākotnēji bija ieinteresēts.
Endrjū J. Moiers vēlāk atklāja, kā iegūt lielu daudzumu penicilīna, patentējot procesu un veicinot cīņu pret infekcijas slimībām. 1987. gadā viņš tika uzņemts Nacionālajā izgudrotāju slavas zālē par lielo penicilīna ražošanas procesu.