Kas ir bise sekvencēšana?

Venters nodibināja uzņēmumu Celera 1998. gadā ar misiju trīs gadu laikā sekvencēt cilvēka genomu. Šis mērķis bija tiešā konkurencē ar jau darbojošos cilvēka genoma projektu, universitāšu konsorciju, kas strādā kopā, lai sekvencētu cilvēka genomu, izmantojot vecāku stratēģiju, ko sauc par sekvencēšanu kartē vai BAC-BAC. Šī metode vispirms ietvēra genoma sadalīšanu 150,000 bāzes pāru daļās, ko sauc par BAC, BAC salikšanu kārtībā un pēc tam detalizētu katra BAC sekvencēšanu.

Visa genoma bises sekvencēšana apiet BAC izveidi un kartēšanu un sākas tieši ar DNS sekvencēšanu. Process sākas ar lielas molekulmasas DNS parauga iegūšanu no interesējošā organisma un fizisku sadalīšanu mazos gabaliņos, izlaižot to caur šauras izmēra šļirci vai apstrādājot to ar ultraskaņu, kas ir veids, kā paraugu sadalīt, izmantojot skaņas viļņus. Nogriešana ir nejaušs process, tāpēc fragmentu secības daļēji pārklājas. Ar cirpšanu netiek īpaši izveidoti sekvencēšanai nepieciešamie 2,000 bāzu pāru fragmenti, drīzāk vēlamā izmēra fragmenti ir jāattīra no maisījuma.

Nākamais solis ir savienot DNS fragmentus ar nesēja DNS, ko sauc par vektoru. Šis process ir pazīstams kā klonēšana, un tas rada sekvencēšanas bibliotēku, no kuras tiks izveidota visa genoma secība. Tiek noteikta katra klona secība bibliotēkā, un datorā tiek izmantota analīze, lai katrā fragmentā atrastu pārklājošas vai nepārtrauktas sekvences. Saliekot pārklājumus, tiek izveidots “kontigs”, kas ir garš nepārtraukts DNS sekvences posms.

Bises klonēšana parasti rada zināmas atstarpes starp kontigiem, jo ​​dažas secības nejauši trūkst bibliotēkā. Nepilnības var aizpildīt, izveidojot jaunu bibliotēku vai izmantojot zināmas sekvences, lai izvērstos uz āru no kontig. Tā kā bise sekvencē DNS fragmentus pēc nejaušības principa, daudzi fragmenti tiek sekvencēti vairāk nekā vienu reizi, radot lielāku pārliecību, ka secība ir pareiza, nekā tad, ja katrs fragments būtu sekvencēts tikai vienu vai divas reizes.

Cilvēka genomu sekvencēja gan Human Genome Project, izmantojot uz kartēm balstītu sekvencēšanu, gan Celera, izmantojot bises sekvencēšanu. Bišu sekvencēšana tagad ir vēlamā metode cita veida genoma sekvencēšanai. Tādā veidā ir sekvencēti daudzu organismu, piemēram, Arabidopsis thaliana auga, rīsu, govs, suņa, vistas, šimpanzes, žurkas, peles, vēžveidīgo zivju un daudzu mikroorganismu, pilnie genomi.