Kaspāžu inhibitori: kas tie ir un kā darbojas
Īsā atbilde
Kaspāžu inhibitori ir vielas, kas bloķē kaspāzes, proti, cisteīna proteāzes, kuras šūnā veic ieprogrammēto šūnu nāvi jeb apoptozi un iekaisuma signālu nogatavināšanu. Tie sastopami dabiski, proti, pašā šūnā un vīrusu genomos, kā arī tiek sintezēti laboratorijā gan pētniecībai, gan kā iespējamas zāles. Bloķējot kaspāzes, tiek apturēts šūnas pašiznīcināšanās mehānisms, taču ne vienmēr tiek izglābta pati šūna.
Organismā katru dienu iet bojā milzīgs skaits šūnu, un lielākā daļa no tām nemirst nejauši, bet gan izpilda precīzi vadītu pašiznīcināšanās programmu. Šo programmu sauc par apoptozi, un tās centrālie izpildītāji ir fermenti, kurus dēvē par kaspāzēm. Nosaukums atspoguļo divas to pazīmes: aktīvajā centrā tām ir cisteīns, un substrāta ķēdi tās pārgriež tieši aiz aspartāta atlikuma.
Kaspāžu inhibitors ir jebkura molekula, kas šo šķelšanu aptur. Bioloģiski tas ir svarīgs regulācijas līdzeklis, jo aktivizēta izpildītājkaspāze darbojas ļoti ātri un neatgriezeniski, tāpēc šūnai ir nepieciešama bremze, kas spēj signālu apturēt vēl pēdējā brīdī. Tieši tādēļ evolūcija ir radījusi veselu olbaltumvielu saimi, kas kaspāzes notur nedarbīgas.
Tikpat labi šo bremzi ir iemācījušies izmantot arī parazīti. Vairāki vīrusi savā genomā nes gēnus, kuru produkti bloķē saimniekšūnas kaspāzes; tādējādi inficētā šūna nepaspēj sevi likvidēt kopā ar vīrusu, un vīrusam paliek laiks pavairoties. Tas ir viens no skaidrākajiem piemēriem tam, ka apoptoze ir arī pretinfekcijas aizsardzības mehānisms, nevis tikai audu atjaunošanās līdzeklis.
Medicīnā kaspāžu inhibitori ir pievilcīgi tāpēc, ka daudzās slimībās šūnas iet bojā par daudz: aknu iekaisumā, sirds infarkta apvidū, sepsē, neirodeģeneratīvās slimībās. Ideja apturēt šo pārmērīgo bojāeju ir loģiska, bet praksē tā ir izrādījusies daudz sarežģītāka, nekā sākotnēji cerēts, un tieši šī pretruna padara tēmu interesantu.
Kas ir kaspāzes un kādos veidos tās iedala
Cilvēka šūnās ir aprakstītas vairākas kaspāzes, un tās nav savstarpēji aizvietojamas. Pēc funkcijas tās iedala trijās grupās, un katrai grupai ir sava vieta signālu ķēdē. Kaspāžu inhibitora izvēle ir jēdzīga tikai tad, ja ir skaidrs, kuru grupu ir jāietekmē.
Visas kaspāzes šūnā sākotnēji atrodas neaktīvā priekšteča formā, ko sauc par prokaspāzi. Iniciatorkaspāzes aktivizējas, kad tās savāc kopā īpašs olbaltumvielu komplekss un tās sāk šķelt cita citu; izpildītājkaspāzes aktivizē iniciatorkaspāzes ar tiešu šķelšanu. Šāda pakāpeniska uzbūve ļauj vājam sākotnējam signālam pārvērsties par spēcīgu, neatgriezenisku atbildi.
| Grupa | Piemēri | Uzdevums |
|---|---|---|
| Iniciatorkaspāzes | Kaspāze 8, 9, 10, 2 | Uztver nāves signālu un aktivizē izpildītājkaspāzes |
| Izpildītājkaspāzes | Kaspāze 3, 6, 7 | Sašķeļ simtiem šūnas olbaltumvielu un veic pašu apoptozi |
| Iekaisuma kaspāzes | Kaspāze 1, 4, 5 | Nogatavina iekaisuma signālvielas un izraisa piroptozi |
Šūnas pašas dabiskie kaspāžu inhibitori
Galvenā dabisko inhibitoru saime ir IAP olbaltumvielas, kuru nosaukums angliski nozīmē apoptozes inhibitorus. Cilvēkā pie tām pieder XIAP, cIAP1, cIAP2 un survivīns. Šīs molekulas piesaistās aktivizētajām kaspāzēm un tās nobloķē; daļa no tām spēj arī pievienot kaspāzei ubikvitīna iezīmi, kas nosūta to uz proteasomu iznīcināšanai.
Šī bremze savukārt ir atslēdzama. Kad mitohondriji saņem nāves signālu, tie starpmembrānu telpā atbrīvo ne tikai citohromu c, bet arī olbaltumvielu Smac, kas piesaistās IAP molekulām un tās atbrīvo no kaspāzēm. Tādējādi apoptoze sākas divkārši: vienlaikus tiek ieslēgta iniciatorkaspāze un izslēgta bremze.
Atsevišķi jāmin FLIP olbaltumviela. Tā pēc uzbūves atgādina kaspāzi 8, bet tai trūkst darbīga aktīvā centra, tāpēc, ieņemot vietu nāves signālu kompleksā, tā darbojas kā tukša atslēga slēdzenē. Šis ir smalks piemērs inhibīcijai, kas notiek nevis ar piesaisti fermenta aktīvajam centram, bet ar konkurenci par vietu kompleksā.
- XIAP: spēcīgākais tiešais kaspāzes 3, 7 un 9 inhibitors cilvēka šūnā.
- cIAP1 un cIAP2: vairāk regulē signālu ceļus augšpus kaspāzēm nekā bloķē pašas kaspāzes.
- Survivīns: saistīts arī ar šūnu dalīšanās vārpstas darbību, tāpēc tam ir divējāda loma.
- FLIP: konkurē ar kaspāzi 8 par vietu nāves receptoru kompleksā.
- Smac un Omi: nav inhibitori, bet gan inhibitoru atcēlēji, kas ļauj apoptozei sākties.
Vīrusu kodētie inhibitori
Vīrusiem ir vienkārša interese: inficētā šūna nedrīkst nomirt agrāk, nekā saražotas jaunas vīrusu daļiņas. Tāpēc vairākas vīrusu saimes kodē olbaltumvielas, kas bloķē saimniekšūnas kaspāzes. Klasiskie mācību piemēri ir govju bakas vīrusa CrmA un baculovīrusu p35.
Abi darbojas pēc līdzīga principa: tie izliekas par substrātu. Kaspāze sāk tos šķelt, bet šķelšanas produkts paliek fermentā iestrēdzis, un ferments vairs nespēj strādāt. Tāda inhibīcija ir ļoti efektīva, jo tā neatgriezeniski izņem fermentu no aprites.
Daži herpesvīrusi kodē arī FLIP līdzinieku, ko apzīmē kā vFLIP. Tas traucē nāves receptoru signālam jau pašā sākumā un vienlaikus stimulē šūnas izdzīvošanas ceļus, kas daļēji izskaidro atsevišķu herpesvīrusu saistību ar audzējiem.
Sintētiskie inhibitori laboratorijā
Pētniecībā visbiežāk izmanto īsus peptīdus, kuriem pievienota ķīmiska grupa, kas ķīmiski piesaistās kaspāzes aktīvajam cisteīnam. Peptīda aminoskābju secība nosaka, kurai kaspāzei šis inhibitors būs piemērotāks, bet atlasība nekad nav pilnīga, un tas ir viens no galvenajiem šīs metodes ierobežojumiem.
Praktiski lietotājam ir jāsaprot divas lietas. Pirmkārt, tā sauktie pankaspāžu inhibitori bloķē visas grupas uzreiz, tāpēc rezultātu nevar attiecināt uz vienu konkrētu fermentu. Otrkārt, tie pie augstākām koncentrācijām iedarbojas arī uz citām cisteīna proteāzēm, piemēram, katepsīniem un kalpaīniem, tāpēc secinājums „apoptozi apturēja kaspāžu bloķēšana” var būt pārsteidzīgs.
- Izvēlas peptīda secību, kas atbilst mērķkaspāzes atpazīstamajai vietai.
- Pievieno reaktīvu grupu, kas neatgriezeniski vai atgriezeniski saistās ar aktīvo cisteīnu.
- Pārbauda iedarbību uz attīrītu fermentu un nosaka atlasību pret citām kaspāzēm.
- Pārbauda šūnu kultūrā, vai patiešām mazinās izpildītājkaspāzes darbība.
- Pārliecinās, vai šūna tiešām izdzīvo, nevis iet bojā pa citu ceļu.
Kā mēra, vai kaspāze ir nobloķēta
Kaspāžu darbību novērtē pēc to substrāta šķelšanas. Laboratorijā lieto mākslīgu substrātu, kas pēc pārgriešanas sāk fluorescēt vai krāsoties, un signāla pieaugums atbilst fermenta aktivitātei. Šī pati metode ļauj pārbaudīt, cik labi inhibitors strādā.
Audos un šūnu kultūrā biežāk izmanto antivielas, kas atpazīst tikai jau sašķelto kaspāzi 3 vai tās sašķelto substrātu PARP. Tas parāda nevis fermenta daudzumu, bet gan to, vai tas patiešām ir aktivizējies. Papildus lieto anneksīna V iekrāsošanu plūsmas citometrijā un TUNEL metodi, kas atklāj sadrumstalotu DNS.
Svarīgs praktisks nosacījums: neviena no šīm metodēm viena pati nepierāda apoptozi. Pārliecinošs slēdziens rodas tikai tad, ja vairākas neatkarīgas metodes norāda uz vienu un to pašu.
Kur tas ir svarīgi klīniski un kurš ārsts ar to nodarbojas
Kaspāžu inhibitori paši par sevi nav ikdienas zāles. Tomēr izpratne par apoptozes regulāciju ir pamatā vairākām mūsdienu ārstēšanas metodēm, un tās parasti saskaras ar konkrētām specialitātēm.
Onkoloģijā daļa audzēju izdzīvo tieši tāpēc, ka pārmērīgi ražo apoptozes bremzes; te mērķis ir pretējs, proti, bremzi noņemt, nevis pastiprināt. Hepatoloģijā un gastroenteroloģijā pētīti kaspāžu inhibitori aknu bojājuma mazināšanai. Reimatoloģijā un imunoloģijā nozīme ir iekaisuma kaspāzēm, kuras ir iesaistītas periodiskā drudža sindromos.
Pacientam praktiskā atziņa ir šāda: nav tādu bezrecepšu preparātu, kas „bloķē šūnu nāvi”, un piedāvājumi par tādiem ir jāuztver ļoti kritiski. Ja ir aizdomas par aknu bojājumu, asins ainas izmaiņām vai atkārtotiem neizskaidrojamiem drudža uzliesmojumiem, jāgriežas pie ģimenes ārsta, kurš nepieciešamības gadījumā nosūtīs pie attiecīgā speciālista.
Ar ko to sajauc
Visbiežāk kaspāžu inhibitorus jauc ar proteasomu inhibitoriem. Abi ietekmē olbaltumvielu likteni šūnā, bet proteasoma sadala olbaltumvielas līdz peptīdiem pilnīgas noārdīšanas nolūkā, savukārt kaspāze veic precīzu, vienu vai dažus griezumus, kas maina olbaltumvielas funkciju. Proteasomu inhibitori ir reģistrētas zāles hematoloģijā; kaspāžu inhibitori nav.
Otra sajaukšana notiek starp nāves veidiem. Apoptoze noris bez iekaisuma, šūna saraujas un tiek apēsta pa daļām; nekroze ir nekontrolēts sabrukums ar iekaisumu; piroptoze ir iekaisuma kaspāžu vadīta nāve ar spēcīgu iekaisuma signālu izdali. Kaspāžu inhibitors ietekmē pirmo un trešo, bet ne otro.
| Nāves veids | Galvenais izpildītājs | Iekaisums |
|---|---|---|
| Apoptoze | Kaspāze 3, 6, 7 | Praktiski nav |
| Piroptoze | Kaspāze 1 un radniecīgās | Izteikts |
| Nekroptoze | RIPK3 un MLKL, ne kaspāzes | Izteikts |
| Nejauša nekroze | Nav noteikta izpildītāja | Izteikts |
Tas, ko kopsavilkums parasti nepasaka
Pats pārsteidzošākais atklājums šajā jomā ir tas, ka kaspāžu bloķēšana bieži nevis izglābj šūnu, bet gan pārslēdz to uz citu nāves ceļu. Kaspāze 8 normāli šķeļ un tādējādi neitralizē olbaltumvielu RIPK1. Ja kaspāzi 8 nobloķē, RIPK1 paliek neskarta, savienojas ar RIPK3, aktivizē MLKL, un šūna iet bojā nekroptozes ceļā, turklāt ar iekaisumu, kura apoptozes gadījumā nebija.
Tas apgriež otrādi intuīciju, ka apoptozes bloķēšana vienmēr ir aizsargājoša. Sepsē vai išēmiskā audā rezultāts var būt sliktāks nekā bez iejaukšanās, jo klusā nāve tiek nomainīta pret troksnīgu. Tieši šis mehānisms lielā mērā izskaidro, kāpēc pankaspāžu inhibitori klīniskajos pētījumos nav devuši gaidīto rezultātu.
Praktiskā mācība pētniekiem ir tāda, ka eksperiments ar pankaspāžu inhibitoru nekad nav pilnīgs bez paralēlas pārbaudes, vai šūnas nav aizgājušas bojā pa nekroptozes ceļu. Bez šīs pārbaudes secinājums par kaspāžu lomu var izrādīties pilnīgi pretējs patiesībai.
Bieži uzdotie jautājumi
Vai kaspāžu inhibitorus var nopirkt aptiekā?
Nē. Latvijā un Eiropas Savienībā nav reģistrētu zāļu, kuru darbības pamatā būtu kaspāžu bloķēšana. Vielas, ko sauc par kaspāžu inhibitoriem, ir laboratorijas reaģenti vai pētāmas vielas klīniskajos pētījumos. Uztura bagātinātāji, kas sola „apturēt šūnu novecošanu”, nav kaspāžu inhibitori.
Vai apoptozes apturēšana palēninātu novecošanu?
Vienkārša apoptozes apturēšana to nedarītu. Apoptoze ir arī aizsargmehānisms, kas likvidē bojātas un potenciāli vēžainas šūnas, tāpēc tās nomākšana palielinātu audzēju risku. Novecošanā daudz lielāka nozīme ir novecojušo šūnu uzkrāšanās un to izdalīto iekaisuma vielu, nevis šūnu nāves apjomam.
Kāpēc kaspāzes sauc tieši par kaspāzēm?
Nosaukums ir salikts no divām fermenta pazīmēm. Burts c norāda uz cisteīnu aktīvajā centrā, bet daļa „asp” norāda, ka šis ferments šķeļ olbaltumvielu ķēdi aiz aspartāta atlikuma. Galotne „āze” ir parastā fermentu nosaukumu galotne.
Vai vīrusu kaspāžu inhibitori padara infekciju smagāku?
Tie palīdz vīrusam ilgāk saglabāt dzīvu inficēto šūnu un tādējādi saražot vairāk vīrusa daļiņu. Vai infekcija kļūst smagāka, atkarīgs no konkrētā vīrusa un saimnieka imunitātes, jo organisms inficētās šūnas var likvidēt arī ar citolītiskajiem limfocītiem, kuri izmanto papildu ceļus.
Kāds sakars kaspāzēm ar vēzi?
Daudzos audzējos apoptozes ceļš ir bojāts vai pārmērīgi nomākts, tāpēc šūnas nemirst tad, kad tām vajadzētu. Tieši tāpēc onkoloģijā interesē nevis kaspāžu inhibitori, bet gan pretējais, proti, vielas, kas noņem dabiskās bremzes un atjauno audzēja šūnas spēju iet bojā.
Vai ir pazīmes, ka man organismā „par daudz apoptozes”?
Tādas atsevišķas pazīmes nav, un to nevar noteikt pēc pašsajūtas vai ar parastu analīzi. Apoptozes līmenis nav klīniski mērāms rādītājs ikdienas praksē. Ja ir noturīgs nespēks, neizskaidrojams svara zudums, ilgstošs drudzis vai izmaiņas asins ainā, ir jāvēršas pie ģimenes ārsta, lai meklētu konkrētu cēloni.