Antisense RNS: kā tā bloķē gēna nolasīšanu
Īsā atbilde
Antisense RNS ir ribonukleīnskābes molekula, kuras nukleotīdu secība ir komplementāra kāda konkrēta gēna informācijas jeb sensa RNS secībai. Tā rodas šūnas kodolā no tā paša vai cita DNS posma un, savienojoties ar mērķa RNS divpavedienu kompleksā, aizkavē olbaltumvielas sintēzi vai maina mērķa molekulas likteni. Dabā tas ir viens no gēnu darbības regulēšanas veidiem, bet medicīnā tas ir kļuvis par zāļu principu, uz kura balstās vairāku retu ģenētisku slimību ārstēšana.
Gēna informācijas ceļš no DNS līdz olbaltumvielai ir vienvirziena. No DNS dubultspirāles tiek nolasīts viens pavediens, un uz tā izveidojas informācijas RNS jeb mRNS, kuru ribosoma pārtulko aminoskābju virknē. Visa šī sistēma balstās uz vienu vienīgu ķīmisku likumu: adenīns saistās ar uracilu, guanīns ar citozīnu. Tieši šo likumu izmanto antisense RNS.
Ja šūnā rodas RNS molekula, kuras burtu secība ir komplementāra mRNS secībai, abas molekulas atrod viena otru un salīp kopā tāpat kā divi DNS pavedieni. Iegūtais divpavedienu posms vairs nav lasāms. Ribosoma nespēj pa to pārvietoties, un olbaltumvielas sintēze apstājas vai vismaz ievērojami samazinās. Turklāt šūnā divpavedienu RNS tiek uztverta kā neparasta struktūra, un vairāki fermenti to atpazīst un noārda.
Ilgu laiku uzskatīja, ka šāda parādība ir galvenokārt baktēriju īpatnība. Baktērijās un plazmīdās antisense RNS regulē kopiju skaitu un tā sauktās toksīna un antitoksīna sistēmas, kas nogalina meitas šūnu, ja tā zaudē plazmīdu. Vēlāk kļuva skaidrs, ka arī cilvēka genomā ievērojama daļa gēnu tiek nolasīti abos virzienos, veidojot dabiskos antisensa transkriptus. Daudzi no tiem pieder pie garajām nekodējošajām RNS.
Praktiskā nozīme šai molekulai ir divējāda. Pirmkārt, tā ir dabisks gēnu klusināšanas mehānisms, kas palīdz šūnai noregulēt, cik daudz konkrētas olbaltumvielas tai vajag. Otrkārt, tā ir kļuvusi par paraugu jaunai zāļu klasei: ja slimību izraisa kāda konkrēta RNS, to var mēģināt neitralizēt ar mākslīgi sintezētu komplementāru molekulu, nevis ar tradicionālu ķīmisku vielu, kas darbojas uz gatavas olbaltumvielas.
Sensa un antisensa pavediens: no kurienes rodas nosaukums
DNS dubultspirālei ir divi pavedieni, un tikai viens no tiem konkrētajā gēnā kalpo par matrici. Pavedienu, kura secība sakrīt ar iegūtās mRNS secību (tikai ar timīnu uracila vietā), sauc par sensa jeb kodējošo pavedienu. Otru, pēc kura faktiski notiek nolasīšana, sauc par antisensa jeb matrices pavedienu.
No tā izriet arī molekulu nosaukumi. Sensa RNS ir tā, kurai ir „jēga" un kuru ribosoma spēj pārtulkot. Antisense RNS ir tai komplementāra molekula, kas pati parasti nekodē nevienu olbaltumvielu, bet spēj piesaistīties sensa molekulai. Tieši tāpēc terminoloģijā to bieži dēvē arī par pretvērsuma RNS.
- Sensa pavediens: DNS pavediens, kura secība atkārtojas mRNS.
- Antisensa pavediens: DNS matrice, pēc kuras RNS polimerāze sintezē mRNS.
- Sensa RNS: mRNS, ko nolasa ribosoma.
- Antisense RNS: mRNS komplementārā molekula, kas bloķē nolasīšanu.
Kā antisense RNS izslēdz gēnu
Bloķēšana nenotiek vienā vienīgā veidā. Atkarībā no tā, kurai mērķa molekulas daļai antisensa molekula piesaistās, sekas ir dažādas. Ja tā aizsedz translācijas sākuma vietu, ribosoma vienkārši nevar pievienoties. Ja tā aizsedz izsaišanas atpazīšanas vietu vēl kodolā, mainās tas, kuri eksoni nonāks gatavajā mRNS.
Vēl viens ceļš ir noārdīšana. Divpavedienu posms piesaista fermentus, kas šķeļ RNS, un mērķa molekula tiek iznīcināta, pirms tā paspēj nokļūt līdz ribosomai. Tieši šo mehānismu izmanto daļa terapeitisko molekulu, jo tas ir neatgriezenisks un tāpēc efektīvāks nekā vienkārša aizsegšana.
- Šūnā rodas vai tiek ievadīta molekula, kas ir komplementāra mērķa RNS.
- Abas molekulas satiekas un saistās pēc bāzu pārošanās principa.
- Veidojas divpavedienu RNS posms, kas ir stērisks šķērslis.
- Ribosoma vai izsaišanas aparāts vairs nevar piekļūt attiecīgajai vietai.
- Vai nu sintēze apstājas, vai arī fermenti noārda mērķa molekulu.
Dabiskie antisensa transkripti cilvēka šūnās
Cilvēka genomā daudzu gēnu tuvumā tiek nolasītas arī pretējā virzienā vērstas RNS. Tās iedala cis tipa transkriptos, kas rodas tieši pretī mērķa gēnam tajā pašā genoma vietā, un trans tipa transkriptos, kas rodas citur, bet spēj atrast savu mērķi šūnā.
Viens no pazīstamākajiem piemēriem ir X hromosomas inaktivācija sieviešu šūnās, kur savstarpēji pretēji vērsti transkripti nosaka, kura hromosoma tiks klusināta. Citi antisensa transkripti darbojas šūnas cikla regulācijā. Tas nozīmē, ka antisensa princips nav laboratorijas izgudrojums, bet gan normālas šūnas ikdiena.
Ar ko to nedrīkst sajaukt
Sarunvalodā jēdzienus mēdz lietot kā sinonīmus, taču bioloģiski tie ir atšķirīgi mehānismi ar atšķirīgām olbaltumvielām un atšķirīgu darbības vietu šūnā. Tas ir svarīgi arī praktiski: no mehānisma atkarīgs, vai zāles darbosies šūnas kodolā vai citoplazmā.
| Molekula | Uzbūve | Kur darbojas | Galvenais mehānisms |
|---|---|---|---|
| Antisense RNS | vienpavediena RNS | kodolā un citoplazmā | tieša saistīšanās ar mērķa RNS |
| siRNS | īsa divpavedienu RNS | citoplazmā | darbojas caur RISC kompleksu |
| MikroRNS | īsa šūnas paša RNS | citoplazmā | daļēja saistīšanās, translācijas nomākums |
| Antisensa oligonukleotīds | ķīmiski pārveidota DNS analogs | galvenokārt kodolā | izsaišanas maiņa vai RNāzes H šķelšana |
No molekulas līdz zālēm
Terapijā reti izmanto neapstrādātu RNS, jo asinīs un audos tā tiek noārdīta dažu minūšu laikā. Tā vietā sintezē antisensa oligonukleotīdus: īsas ķēdītes, kurās nomainīts cukura un fosfāta skelets, piemēram, fosforotioāta saites vai 2. pozīcijas modifikācijas ribozē. Šādas molekulas ir noturīgas, ilgāk uzturas šūnā un mazāk kairina iedzimto imunitāti.
Medicīnā šī pieeja ir devusi rezultātu tieši retajās ģenētiskajās slimībās. Spinālās muskuļu atrofijas gadījumā oligonukleotīdu ievada mugurkaula kanālā, un tas maina SMN2 gēna izsaišanu tā, lai šūna izveidotu pilnvērtīgu olbaltumvielu. Dišēna muskuļu distrofijas gadījumā izmanto tā saukto eksonu izlaišanu, lai bojātais gēns atkal spētu radīt īsāku, bet daļēji funkcionējošu distrofīnu. Abos gadījumos zāles nelabo DNS, tās maina tikai to, kā tiek nolasīta RNS.
Galvenais praktiskais ierobežojums ir nokļūšana mērķa audos. Oligonukleotīdi labi uzkrājas aknās un nierēs, sliktāk nonāk smadzenēs, muskuļos un caur asins un smadzeņu barjeru. Tieši tāpēc dažas no šīm zālēm ievada intratekāli vai izmanto īpašus piesaistes ligandus.
Kā to pēta laboratorijā
Pētniecībā antisensa pieeja jau gadu desmitiem kalpo par rīku, ar ko noskaidrot gēna funkciju: ja konkrēto RNS nomāc un šūnai kaut kas pārstāj darboties, ir iegūta norāde par gēna lomu. Mūsdienās šo lomu bieži pārņēmusi RNS interference un genoma rediģēšana, bet antisensa metode joprojām ir neaizstājama tur, kur jāmaina izsaišana, nevis jāiznīcina gēns.
- Ziemeļblota un kvantitatīvā PCR: parāda, cik daudz mērķa RNS palicis.
- RNS sekvencēšana ar virziena saglabāšanu: atklāj dabiskos antisensa transkriptus.
- Rietumblots: pārbauda, vai tiešām samazinājies olbaltumvielas daudzums.
- Reportiergēnu sistēmas: mēra, vai mainījusies izsaišanas variantu attiecība.
Riski un blakusparādības, par kurām runā reti
Antisensa zāles nav nekaitīgas tikai tāpēc, ka tās ir „dabiskas". Īsa oligonukleotīdu ķēde var daļēji saistīties arī ar citām RNS, kurām ir līdzīgs posms, un radīt neparedzētu ietekmi. Tāpēc katras molekulas izstrādē veic plašu bioinformātisku pārbaudi pret visu genomu.
Otra problēma ir klases efekti: fosforotioātu saturošas molekulas var saistīties ar asins olbaltumvielām, ietekmēt asinsreces rādītājus, kairināt nieres un izraisīt iekaisuma reakciju ievades vietā. Intratekālas ievades gadījumā iespējamas galvassāpes un muguras sāpes pēc procedūras. Šo iemeslu dēļ šādu ārstēšanu vada specializēti centri, un pacientam regulāri kontrolē nieru un asins rādītājus.
Ieskats, ko kopsavilkumā parasti neatrast
Antisense RNS efektivitāte praksē ir atkarīga ne tik daudz no komplementaritātes, cik no mērķa RNS telpiskās formas. RNS molekula šūnā nav taisna lente: tā saloka pati sevi cilpās un matadatās, un liela daļa teorētiski ideālu saistīšanās vietu reāli ir noslēptas iekšpusē vai aizsegtas ar olbaltumvielām. Tieši tāpēc, izstrādājot šādas zāles, izmēģina desmitiem secību un atlasa tās dažas, kas tiešām strādā.
Otrs mazāk zināms fakts ir tas, ka daļa dabisko antisensa transkriptu nemaz nedarbojas caur saistīšanos ar mērķa RNS. To ietekme rodas jau no paša nolasīšanas procesa, kas fiziski traucē pretējā virzienā strādājošajai polimerāzei vai maina hromatīna blīvumu attiecīgajā vietā. Rezultāts izskatās vienāds, bet mehānisms ir pavisam cits.
Bieži uzdotie jautājumi
Vai antisense RNS maina cilvēka DNS?
Nē. Tā darbojas tikai ar RNS starpposmu, tāpēc gēna teksts DNS paliek neskarts. Tieši ar to antisensa pieeja atšķiras no genoma rediģēšanas, kur izmaiņas DNS ir paliekošas. Tas nozīmē arī to, ka antisensa zāļu iedarbība ar laiku izzūd un ievadi nākas atkārtot.
Kāda ir atšķirība starp antisense RNS un vakcīnu ar mRNS?
Tie ir pretēji pēc mērķa. Vakcīnas mRNS ir sensa molekula, kas šūnai dod norādi izveidot noteiktu olbaltumvielu. Antisense molekula, gluži otrādi, neļauj kādu olbaltumvielu izveidot. Kopīgs tām ir tikai tas, ka abas ir nukleīnskābes, nevis klasiskas ķīmiskas zāles.
Vai antisensa zāles ir pieejamas Latvijā?
Šīs zāles lieto retu ģenētisku slimību gadījumā, un tās nozīmē un ievada specializēti centri, nevis ģimenes ārsts. Pieejamība un kompensācijas kārtība laika gaitā mainās, tāpēc precīzu informāciju vajadzētu prasīt ārstējošajam speciālistam vai reto slimību koordinējošajai ārstniecības iestādei.
Kāpēc antisensa molekulai jābūt ķīmiski pārveidotai?
Nemodificēta RNS asinīs tiek sašķelta ļoti ātri un praktiski nepaspēj nonākt līdz mērķa šūnai. Modifikācijas cukura un fosfāta skeletā padara molekulu noturīgu pret fermentiem, uzlabo tās uzsūkšanos šūnā un samazina nevēlamu imūnās sistēmas reakciju.
Vai antisense RNS sastopama arī veselā cilvēka organismā?
Jā. Cilvēka genomā liela daļa gēnu apgabalu tiek nolasīti abos virzienos, un šādi radušās molekules piedalās gēnu aktivitātes regulēšanā, tostarp X hromosomas inaktivācijā. Tas ir normāls process, nevis bojājuma pazīme.
Vai šo principu var izmantot pret vīrusiem vai vēzi?
Teorētiski jā, un šādi pētījumi notiek jau ilgi. Praksē grūtības rada gan zāļu nogādāšana tieši vajadzīgajās šūnās, gan vīrusu spēja strauji mainīt savu secību un tādējādi izvairīties no saistīšanās. Tāpēc līdz šim vislabākos rezultātus ir devušas nevis infekcijas, bet iedzimtas slimības ar vienu skaidri zināmu mērķa secību.