Antivielas pret kaspāzēm laboratorijā

Antiviela ir olbaltumviela, kuras augšējā daļa ir izveidota tā, lai tā atpazītu īsu, noteiktu molekulas posmu, ko sauc par epitopu. Kaspāžu gadījumā epitops var atrasties fermenta priekšējā daļā, tā apakšvienībās vai tieši šķelšanas vietā.

Lai antivielu izgatavotu, izvēlas īsu aminoskābju virkni no attiecīgās kaspāzes, sintezē to un izmanto imunizācijai. Pēc tam iegūtos serumus vai šūnu klonus pārbauda pret mērķa olbaltumvielu un pret radniecīgajām kaspāzēm, jo saimes locekļi savā starpā ir līdzīgi.

Tirdzniecībā tās parasti tiek aprakstītas ar trim rādītājiem: pret kuru kaspāzi tās vērstas, vai tās atpazīst tikai aktīvo formu un kurām metodēm tās ir pārbaudītas. Antiviela, kas lieliski strādā Vestern blota metodē, ne vienmēr derēs audu preparātā, jo tajā olbaltumvielas ir fiksētas un to forma ir mainīta.

Izvēle starp veidiem nav gaumes jautājums: tā nosaka rezultāta atkārtojamību. Pētījumos, kuros rezultāts jāspēj atkārtot pēc gadiem, arvien biežāk priekšroku dod rekombinantām antivielām, jo to secība ir zināma un nemainīga.

Kaspāze šūnā gandrīz vienmēr ir klātesoša, bet parasti neaktīvā priekšteča veidā. Tāpēc antiviela, kas atpazīst fermentu kopumā, iekrāsos gandrīz visas šūnas, un no tā par apoptozi nevar secināt neko.

Aktivācijas laikā priekštecis tiek pāršķelts, un šķēluma vietā atsedzas jauns molekulas gals, kura iepriekš nebija. Antiviela, kas izgatavota tieši pret šo jauno galu, saistās tikai ar jau aktivēto fermentu. Tieši šāda antiviela pret pāršķelto trešo kaspāzi ir kļuvusi par visplašāk lietoto apoptozes marķieri audu preparātos.

Praktiski tas nozīmē, ka reaģenta aprakstā vārdi par pāršķeltu formu nav sīkums, bet metodes būtība. Ja tiek izmantota nepareiza antiviela, iegūtais attēls parādīs fermenta esamību, nevis tā darbību.

• Antiviela pret kopējo formu: parāda, vai ferments šūnā vispār ir.
• Antiviela pret pāršķelto formu: parāda, ka ferments ir aktivēts.
• Antiviela pret substrāta pāršķelto produktu: parāda, ka ferments ir paveicis darbu.
• Mākslīgs substrāts ar krāsvielu: mēra aktivitāti šķīdumā, bet nerāda vietu audos.
• Zondes, kas piesaistās aktīvajam centram: iezīmē aktīvo fermentu dzīvās šūnās.

Katra metode atbild uz citu jautājumu. Vestern blota metode parāda, kāda izmēra fragmenti paraugā ir, un tāpēc ļauj pārliecināties, ka redzamais tiešām ir pāršķelta forma. Imūnhistoķīmija parāda, kurās audu vietās un kurās šūnās tas notiek. Plūsmas citometrija ļauj saskaitīt šūnas ar aktīvu fermentu lielā šūnu populācijā.

Izvēle atkarīga arī no parauga. Formalīnā fiksēti un parafīnā ieguldīti audi prasa epitopa atsegšanu karsējot, jo fiksācija molekulas saista savā starpā. Šūnu kultūrā šāda apstrāde nav vajadzīga, bet ir svarīgi, lai šūnas tiktu fiksētas pietiekami ātri, pirms fermentu darbība turpinās jau ārpus organisma.

1. Paraugu fiksē un sagatavo griezumus vai olbaltumvielu ekstraktu.
2. Ja nepieciešams, karsējot atsedz epitopu un nomāc nespecifisku saistīšanos.
3. Pievieno primāro antivielu pret izvēlēto kaspāzes formu.
4. Nomazgā nesaistīto daļu un pievieno sekundāro antivielu ar krāsvielu vai fermentu.
5. Attīsta signālu, iekrāso kodolus un novērtē attēlu vai izmēra signāla stiprumu.

Antivielu specifika nav pašsaprotama. Kaspāzes saimes locekļi ir strukturāli līdzīgi, un atsevišķas antivielas atpazīst vairāk nekā vienu no tiem. Tāpēc katrā darbā vajadzīgas kontroles, kas parāda, ka signāls nāk tieši no domātā mērķa.

Pozitīvā kontrole ir paraugs, kurā apoptoze ir droši izraisīta ar zināmu ietekmi. Negatīvā kontrole ir tas pats paraugs bez primārās antivielas, kā arī paraugs, kurā fermenta darbība ir nobloķēta. Vēl pārliecinošāks pierādījums ir signāla izzušana, ja attiecīgā gēna ekspresija ir izslēgta.

Attēla vērtēšanā svarīgi arī tas, kā signāls izskatās. Apoptozes gadījumā iekrāsojas atsevišķas šūnas, bieži ar sarukušu kodolu un saplūdušu citoplazmu, nevis vienmērīgs plašs laukums. Difūzs krāsojums visā preparātā daudz biežāk norāda uz metodes kļūdu nekā uz masveida šūnu nāvi.

• Pozitīvs paraugs ar zināmā veidā izraisītu apoptozi.
• Paraugs bez primārās antivielas, lai izslēgtu fona krāsojumu.
• Paraugs ar nobloķētu fermenta darbību.
• Pārbaude Vestern blota metodē, ka fragmenta izmērs atbilst pāršķeltajai formai.
• Vairāku metožu saskaņotība, nevis viens attēls kā vienīgais pierādījums.

Pētniecībā šie reaģenti tiek izmantoti ļoti plaši: lai novērtētu, cik daudz audzēja šūnu iet bojā pēc ķīmijterapijas vai staru terapijas izmēģinājuma apstākļos, lai izpētītu nervu šūnu zudumu eksperimentālos modeļos un lai pārbaudītu jaunu vielu ietekmi uz šūnām.

Klīniskajā patoloģijā tie tiek izmantoti izvēlētos uzdevumos, piemēram, atsevišķu audu bojājumu vērtēšanā, bet tā nav standarta analīze, ko pacients varētu nodot. Diagnozi neuzstāda pēc apoptozes marķiera, jo šūnu bojāeja notiek gan veselos, gan slimos audos, un pats par sevi šis rādītājs neko nenosaka.

Tāpat svarīgi saprast, ka antivielas pret kaspāzēm nekad nav bijušas un nevar būt zāles šo fermentu bloķēšanai organismā. Iemesls ir vienkāršs: antivielas ir lielas molekulas, kas nespēj šķērsot šūnas membrānu, bet kaspāzes atrodas šūnas iekšienē. Fermentu darbības ietekmēšanai izmanto mazas molekulas, kuras spēj iekļūt šūnā.

Šī tēma ir viena no tām, kurās nosaukumu līdzība rada visvairāk neskaidrību. Vairākas pilnīgi atšķirīgas lietas tiek apzīmētas ar līdzīgiem vārdiem.

• Antivielas pret kaspāzēm nav kaspāžu inhibitori: inhibitori ir mazas molekulas, kas bloķē fermenta darbību.
• Tās nav organisma ražotas aizsargvielas pret infekciju, bet laboratorijas reaģenti.
• Antiviela pret kopējo formu nav tas pats, kas antiviela pret pāršķelto formu.
• Apoptozes marķieris nav vēža marķieris: tas nerāda audzēja esamību.
• Kaspāzes nesašķeļ antivielas kā savu mērķi: tās darbojas šūnas iekšienē.

Pirmā ir laika jautājums. Aktīva kaspāze šūnā pastāv salīdzinoši īsu brīdi, jo pēc tam šūna sadalās un to aprij kaimiņi. Tāpēc audu preparātā redzamais šūnu skaits ar pozitīvu krāsojumu nav tas pats, kas kopējais bojā gājušo šūnu skaits: tas ir tikai momentuzņēmums. Audos, kur makrofāgi strādā ātri, apoptoze var būt intensīva, bet pozitīvo šūnu skaits neliels.

Otrā ir tā pati parādība, kas rada kļūdas arī citos apoptozes pētījumos: izpildošās kaspāzes aktivitāte ne vienmēr nozīmē šūnas nāvi. Nervu sistēmā, muskuļu un acs lēcas šūnu nobriešanā ierobežota šo fermentu darbība ir normāla un šūnu nenogalina. Tāpēc secinājumu par bojāeju nekad nebalsta tikai uz vienu krāsojumu.

Trešā, praktiskā: reaģenta cena un pieejamība ilgtermiņā ir daļa no metodes. Poliklonālas antivielas partija reiz beidzas, un jaunā partija var uzvesties citādi. Tieši tāpēc laboratorijas, kas plāno ilgstošus pētījumus, izvēlas monoklonālas vai rekombinantas antivielas un saglabā precīzu informāciju par katru izmantoto partiju.