Kas ir Western Blot protokols?

Western blot protokola pirmā daļa sākas ar audu savākšanu. Šos paraugus ņem vai nu no dzīviem audiem, vai no šūnu kultūras. Audi tiek sadalīti un tiek ievadīti dažādi inhibitori, piemēram, proteāze vai fosfatāze, lai neļautu fermentiem veikt gremošanu. Šo protokola daļu parasti apstrādā aukstā temperatūrā, lai saglabātu audus.

Gēla elektroforēzes process ir nākamais Western blot protokola solis. Šajā daļā olbaltumvielas identificē ar dažādiem faktoriem, piemēram, molekulmasu vai elektrisko lādiņu. Šo procesu visbiežāk pabeidz, izmantojot poliakrilamīda gēlus ar nātrija dodecilsulfāta buferšķīdumu. Būtībā proteīni kļūst negatīvi uzlādēti un virzās uz pozitīvi lādētu elektrodu gēlā.

Olbaltumvielu pārnešana ir nākamā vispārējā Western blot procesa daļa. Uz želejas uzliek membrānu, kam seko filtrpapīrs. Kad tiek ievadīta elektriskā strāva, olbaltumvielas tiek ievilktas membrānā. To sauc par faktisko analīzes “blotēšanas” daļu. Membrānas ir ļoti trauslas un viegli pakļautas bojājumiem.

Pareizai Western blot protokola plūsmai ir nepieciešams solis, kas pazīstams kā saistīšana. Lai novērstu pašu proteīnu piesārņošanu ar antivielām, kas jāpievieno, ir jāievieš sava veida aizsardzība. Visizplatītākais bloķēšanas veids izmanto beztauku sauso pienu un mazgāšanas līdzekli. Tas saistās ar atvērtajiem plankumiem membrānā un nodrošina skaidrākus rezultātus, pievienojot antivielu.

Atklāšana ir nākamais solis saskaņā ar pareizo protokolu. Olbaltumvielas tiek ievadītas antivielām, kas ir saistītas ar noteiktu fermentu, kas sniegs pētniekiem vēlamo informāciju. Antivielu inkubē ar membrānu 30 minūtes vai ilgāk. Pēc tam membrānu mazgā un ievada sekundāro antivielu, kas saistās ar pirmo. Bieži vien luminiscējošu līdzekli izmanto, lai palīdzētu zinātniekiem identifikācijas procesā.

Materiālu vēlreiz mazgā, lai noņemtu visus nesaistītos priekšmetus. Krāsoto joslu lieluma analīze atklāj informāciju par konkrēta proteīna pamanāmību un apjomu. To parasti aizpilda dažas reizes, lai nodrošinātu pareizu analīzi. Noteikšanas iespējas ietver rentgena starus, krāsvielas un ķīmiskas vielas.