Kas ir RNS amplifikācija?

Polimerāzes, ko izmanto klasiskajā amplifikācijā, strādā ar DNS matricu. Tāpēc no RNS vispirms izveido komplementāru DNS ķēdi, izmantojot fermentu reverso transkriptāzi, kas sākotnēji atklāts retrovīrusos. Iegūto molekulu sauc par cDNS, un tā ir gan stabilāka, gan piemērota tālākai pavairošanai.

Svarīga detaļa ir tas, ar ko reversā transkripcija sākas. Praimeri var būt trīs veidu, un izvēle tieši ietekmē, kāda informācija galarezultātā būs redzama.

• Oligo(dT) praimeri piesaistās pie informatīvās RNS poliadenilētās astes, tātad nolasa galvenokārt nobriedušus transkriptus.
• Nejaušas secības jeb random praimeri piesaistās visur, tāpēc uztver arī RNS bez poliadenilētas astes un daļēji sadalītus paraugus.
• Gēnam specifiski praimeri nolasa tikai vienu izvēlētu mērķi, kas ir izdevīgi vīrusu diagnostikā.
• Vīrusu testos praimeru vietas izvēlas ģenētiski stabilos vīrusa genoma apgabalos, lai mutācijas nemazinātu testa jutību.

Divas amplifikācijas pieejas pēc principa atšķiras ļoti būtiski. Eksponenciālajā katra jaunizveidotā molekula pati kļūst par matricu nākamajā ciklā, tāpēc produkta daudzums strauji aug, bet sākotnējās proporcijas var izkropļoties. Lineārajā katra sākotnējā molekula kalpo par matricu daudzkārt, bet kopijas par matricām nekļūst, tāpēc molekulu savstarpējās attiecības saglabājas tuvāk patiesībai.

Tieši tāpēc gēnu izpausmes pētījumos un vienas šūnas transkriptomikā bieži izmanto lineāru in vitro transkripciju ar T7 polimerāzi, nevis tikai ciklisku pavairošanu. Diagnostikā, kur vajag pēc iespējas ātrāk pateikt, vai mērķis vispār ir klāt, priekšroka ir eksponenciālajām metodēm.

Reālā laika reversās transkripcijas PCR ir visbiežāk lietotā RNS amplifikācijas metode klīniskajā laboratorijā. Tās stiprā puse ir tā, ka produkta uzkrāšanos redz reakcijas gaitā, nevis tikai beigās, un signāla parādīšanās brīdis netieši norāda uz sākotnējo molekulu daudzumu.

1. Paraugu savāc piemērotā transporta vidē un nogādā laboratorijā, ievērojot temperatūras prasības.
2. Nukleīnskābes izdala no parauga, atbrīvojoties no olbaltumvielām un reakciju kavējošām vielām, piemēram, hemoglobīna vai gļotu komponentiem.
3. Reversā transkriptāze izveido cDNS ķēdi pēc RNS matricas.
4. Sākas cikliskā daļa: matricas atdalīšana augstā temperatūrā, praimeru piesaistīšanās zemākā temperatūrā un jaunās ķēdes sintēze.
5. Katrā ciklā fluorescējoša zonde vai krāsviela dod gaismas signālu, un iekārta to nolasa.
6. Iekārta nosaka ciklu, kurā signāls pārsniedz fona līmeni; jo agrāk tas notiek, jo vairāk mērķa molekulu paraugā bija.

RNS amplifikācija ir tik jutīga, ka spēj pamanīt pat dažas molekulas, un tieši tāpēc tā ir tik viegli maldināma. Laboratorijas kvalitātes sistēmā katram testam līdzi iet kontroles paraugi, un bez tiem atbildi neizsniedz.

Būtiskākā kļūdas iespēja ir piesaiste no iepriekšējiem paraugiem. Amplificētā produkta koncentrācija laboratorijas gaisā var būt tik liela, ka viena atvērta mēģene piesārņo veselu sēriju. Tāpēc darbs sadalīts telpās ar vienvirziena plūsmu: reaģentu sagatavošana, parauga pievienošana un amplifikācija notiek atsevišķi.

• Negatīvā kontrole parāda, vai reaģenti vai vide nav piesārņoti.
• Pozitīvā kontrole apliecina, ka reakcija vispār darbojas.
• Iekšējā kontrole jeb kontroles gēns pierāda, ka paraugā tiešām bija šūnu materiāls un ka reakcija netika kavēta.
• Kalibratori ar zināmu koncentrāciju vajadzīgi, ja jāizsaka rezultāts skaitliski, piemēram, vīrusa slodze.
• Kušanas līknes analīze vai zondes specifika apstiprina, ka pavairots ir tieši paredzētais fragments.

Elpceļu infekciju diagnostikā RNS amplifikācija ļauj atšķirt gripas vīrusus, respiratori sincitiālo vīrusu un koronavīrusus no viena parauga. HIV un C hepatīta gadījumā tā ir standarta metode vīrusa daudzuma noteikšanai asinīs, un tieši šis rādītājs parāda, vai ārstēšana darbojas.

Onkoloģijā ar RNS amplifikāciju nosaka saplūšanas transkriptus, kas rodas hromosomu pārkārtojumu dēļ, un pēc tiem gan precizē diagnozi, gan seko minimālajai atlikušajai slimībai. Transplantoloģijā un infektoloģijā to izmanto vīrusu reaktivācijas uzraudzībai. Pētniecībā šī tehnoloģija ir pamats visai transkriptomikai, tostarp vienas šūnas RNS sekvencēšanai.

Atsevišķa joma ir jaundzimušo un iedzimtu slimību diagnostika, kā arī audu saderības un transplantāta atgrūšanas uzraudzība, kur vērtē konkrētu gēnu izpausmes izmaiņas. Mikrobioloģijā šī pieeja ļauj noteikt arī to, vai atrastais ierosinātājs ir dzīvotspējīgs, jo dažas RNS molekulas baktērijā saglabājas tikai tad, kad tā ir aktīva.

Pozitīvs molekulārais tests nozīmē, ka paraugā bija attiecīgās nukleīnskābes fragments. Tas ne vienmēr nozīmē, ka cilvēka organismā ir dzīvotspējīgs, lipīgs ierosinātājs, jo sadalītas vīrusa RNS atliekas var saglabāties ilgāk nekā pati infekcija. Tāpēc atbilde vienmēr jāvērtē kopā ar klīnisko ainu, un to dara ārsts, nevis pati laboratorija.

Tāpat cikla skaitlis, ko dažkārt uzrāda atbildē, nav tiešs vīrusa daudzuma mērs. To ietekmē parauga paņemšanas kvalitāte, transporta laiks, izmantotais testa komplekts un iekārta, tāpēc dažādu laboratoriju skaitļus savstarpēji salīdzināt nevar.

Trešais pārpratums ir domāt, ka jutīgāks tests vienmēr ir labāks. Ļoti jutīga metode atrod arī nenozīmīgus atradumus, un katrs atrastais fragments prasa izskaidrojumu. Tāpēc testa izvēle ir atkarīga no klīniskā jautājuma: vienā situācijā svarīgi neko nepalaist garām, citā svarīgāk ir pārliecība, ka pozitīvs rezultāts tiešām nozīmē slimību.

Pirmais pārpratums ir RNS amplifikācija un RNS interference. Pirmais ir laboratorijas paņēmiens molekulu pavairošanai, otrais ir dabisks šūnas mehānisms, kurā mazas RNS molekulas apklusina gēnu izpausmi. Nosaukumi līdzīgi, jēga pretēja.

Otrs pārpratums ir amplifikācija laboratorijā un gēnu amplifikācija audzēja šūnā. Pēdējā ir reāla ģenētiska parādība, kurā audzēja šūnā palielinās kāda gēna kopiju skaits, un tai ir tieša nozīme ārstēšanas izvēlē.

Trešais ir molekulārā testa un antigēna testa jaukšana. Antigēna tests meklē vīrusa olbaltumvielu bez jebkādas pavairošanas, tāpēc tas ir ātrāks un lētāks, bet mazāk jutīgs, īpaši tad, kad ierosinātāja daudzums ir neliels.

Vājākais posms visā ķēdē gandrīz nekad nav pati amplifikācija, bet preanalītiskais posms. RNS sadalīšanās sākas jau paraugā, un tās pakāpi laboratorijā vērtē ar īpašiem kvalitātes rādītājiem, kas balstās uz ribosomu RNS fragmentu attiecību. Ja šis rādītājs ir slikts, no pavairošanas iznāks skaisti dati par sliktu paraugu.

Otra netriviāla lieta ir tā, ka reversā transkriptāze strādā mazāk precīzi nekā labākās DNS polimerāzes un turklāt slikti tiek galā ar RNS vietām, kur molekula pati sevī izveido stingru telpisku struktūru. Tāpēc dažus genoma apgabalus pavairot ir grūtāk nekā citus, un testu izstrādē mērķa vietu izvēlas ne tikai pēc specifiskuma, bet arī pēc tā, cik brīvi ferments tur var pārvietoties.