Kas ir rekombinantais cilvēka proteīns?

Ja saimniekšūna nolasa nemainītu cilvēka gēna kodējošo daļu, tad aminoskābju secība ir identiska cilvēka olbaltumvielai. Atšķirības rodas vēlāk, proteīna „apstrādes“ posmā: pie olbaltumvielas var tikt piestiprinātas cukuru ķēdes, fosfātu grupas, var tikt nogriezts signālpeptīds, var izveidoties disulfīdu tiltiņi un molekula var salocīties pareizi vai nepareizi.

Tieši glikozilācija ir galvenais atšķirību avots. Cukuru ķēžu sastāvs ietekmē olbaltumvielas izturību asinīs, tās saistīšanos ar receptoriem un to, cik ātri to izņem aknas. Divi eritropoetīna preparāti ar identisku aminoskābju secību var atšķirties pēc darbības ilguma tikai cukuru ķēžu dēļ.

Dažkārt secība tiek apzināti mainīta. Ātras darbības insulīna analogos ir pārvietotas vai aizstātas atsevišķas aminoskābes, lai molekulas zemādā mazāk saķeptu kopā un ātrāk uzsūktos. Šādu produktu vairs nesauc par cilvēka insulīnu, bet gan par insulīna analogu.

Ceļš no gēna līdz flakonam ir garš un katrs posms ir reglamentēts. Vienkāršotā veidā tas izskatās šādi.

1. Nosaka vajadzīgās olbaltumvielas gēna kodējošo secību un sintezē vai pavairo atbilstošu DNS fragmentu.
2. Fragmentu iesēdina vektorā (plazmīdā vai vīrusa nesējā) kopā ar promotoru, kas saimniekšūnā ieslēdz tā nolasīšanu.
3. Vektoru ievada saimniekšūnā un atlasa tās šūnas, kuras to ir uzņēmušas un stabili uztur.
4. No vienas šūnas izaudzē klonu un no tā izveido galveno šūnu banku, ko iesaldē un izmanto visai turpmākajai ražošanai.
5. Šūnas pavairo bioreaktorā, kontrolējot temperatūru, skābekli, pH un barotni.
6. Proteīnu atdala no šūnām vai barotnes un attīra vairākos hromatogrāfijas posmos, paralēli veicot vīrusu inaktivāciju un filtrāciju.
7. Gatavo vielu pārbauda pēc identitātes, tīrības, aktivitātes un piemaisījumiem, pēc tam formulē, iepilda un marķē.

Saimniekšūna nav tehniska sīkumlieta: tā nosaka, kādu molekulu vispār ir iespējams iegūt. Baktērija aug ātri un lēti, bet tai nav aparāta cukuru ķēžu piestiprināšanai un tā slikti tiek galā ar sarežģīti salocītām molekulām. Zīdītāju šūnu kultūra ir dārga un lēna, toties tā veido cilvēkam tuvu glikozilāciju.

Terapeitiskos rekombinantos proteīnus var sagrupēt pēc tā, ko tie organismā aizvieto vai maina. Daļa aizstāj trūkstošu molekulu, daļa pastiprina kādu dabisku signālu, daļa bloķē mērķi, kas slimībā darbojas par daudz.

• Aizvietošana: insulīns cukura diabēta gadījumā, VIII un IX recēšanas faktors hemofilijas gadījumā, fermenti iedzimtu uzkrāšanās slimību gadījumā.
• Stimulācija: eritropoetīns eritrocītu veidošanai, granulocītu koloniju stimulējošais faktors leikocītu atjaunošanai pēc ķīmijterapijas.
• Augšanas regulācija: somatropīns bērniem ar pierādītu augšanas hormona deficītu.
• Mērķa bloķēšana: monoklonālās antivielas un receptoru saplūšanas proteīni reimatoloģijā, gastroenteroloģijā, onkoloģijā un dermatoloģijā.
• Diagnostika un pētniecība: standartvielas analīžu kalibrēšanai, antigēni testiem, fermenti molekulārajā bioloģijā.

Galvenā specifiskā problēma olbaltumvielu zālēm ir imunogenitāte. Organisms var atpazīt ievadīto molekulu kā svešu un izveidot pret to antivielas. Vieglākajā gadījumā tas neko nemaina, smagākā zāles zaudē iedarbību, bet retos gadījumos antivielas sāk neitralizēt arī paša organisma attiecīgo olbaltumvielu.

Otra problēma ir ražošanas nepastāvība. Dzīva šūnu kultūra reaģē uz barotnes sastāvu, temperatūru un attīrīšanas apstākļiem, tāpēc bioloģiskām zālēm ražošanas process praktiski ir daļa no pašas zāļu definīcijas. Tieši šī iemesla dēļ bioloģisko zāļu kopijas sauc par biolīdziniekiem, nevis par ģenēriskām zālēm: absolūti identisku molekulu atkārtot nav iespējams, iespējams ir pierādīt līdzvērtību.

Ar šīm zālēm strādā tā speciālista rokās, kura jomā ir pamatslimība: endokrinologs ar insulīnu un augšanas hormonu, hematologs ar recēšanas faktoriem un eritropoetīnu, reimatologs, gastroenterologs un onkologs ar antivielām. Ja pēc ilgstoši efektīvas terapijas iedarbība pēkšņi zūd vai parādās izsitumi, drudzis, elpas trūkums pēc injekcijas, par to jāziņo ārstējošajam ārstam.

Olbaltumvielu nevar apstiprināt ar vienu analīzi tā, kā to dara ar vienkāršu ķīmisku vielu. Izmanto savstarpēji papildinošu metožu kopumu, kas atsevišķi raksturo secību, masu, telpisko uzbūvi, cukuru ķēdes un bioloģisko aktivitāti.

Ražotnē un laboratorijā tipiski tiek lietota elektroforēze molekulmasas un tīrības novērtēšanai, dažādu veidu hromatogrāfija attīrīšanai un satura noteikšanai, masspektrometrija secības un modifikāciju apstiprināšanai, kā arī šūnu tests, kas parāda, vai molekula tiešām iedarbojas uz savu receptoru.

• Elektroforēze: parāda molekulas izmēru un rupjus piemaisījumus.
• Šķidruma hromatogrāfija: atdala pareizi salocīto formu no agregātiem un fragmentiem.
• Masspektrometrija: apstiprina aminoskābju secību un pēctranslācijas modifikācijas.
• Izoelektriskā fokusēšana: atdala formas pēc lādiņa, kas atšķiras glikozilācijas dēļ.
• Bioloģiskās aktivitātes tests šūnu kultūrā: parāda, vai molekula strādā, ne tikai to, vai tā ir klāt.

Sarunvalodā jēdzieni „sintētisks“, „bioidentisks“, „ģenētiski modificēts“ un „rekombinants“ bieži tiek lietoti kā sinonīmi, lai gan nozīmē pavisam dažādas lietas. Skaidrība šeit ir noderīga, jo no tā ir atkarīgs, kā produkts tiek ražots un pārbaudīts.

• Ķīmiski sintezēts peptīds top mēģenē no atsevišķām aminoskābēm bez dzīvas šūnas; tā var iegūt tikai īsas molekulas.
• No plazmas iegūtas zāles nāk no cilvēka donoru asinīm un prasa donoru pārbaudi un vīrusu inaktivāciju; rekombinants analogs to neprasa.
• Dzīvnieku izcelsmes hormons ir cita suga molekulārā līmenī, nevis cilvēka olbaltumviela, kas ražota citā šūnā.
• Biolīdzinieks ir reģistrētu bioloģisku zāļu līdzvērtīga versija, nevis tā pati molekula pēc definīcijas.
• Gēnu terapija ievada organismā gēnu, lai proteīnu ražotu pats pacients; rekombinantās zāles ievada gatavu proteīnu.

Dopinga kontrolē rekombinanto eritropoetīnu var atšķirt no paša organisma izstrādātā, un tas notiek nevis pēc daudzuma, bet pēc molekulas lādiņa. Cukuru ķēdes, ko piestiprina peles vai kāmja izcelsmes šūnu kultūra, atšķiras no tām, ko piestiprina cilvēka niere, un šī atšķirība maina to, kā molekula pārvietojas elektriskā laukā. Urīna paraugā rekombinantais un endogēnais eritropoetīns tādēļ veido atšķirīgus joslu zīmējumus.

Tas pats princips izskaidro, kāpēc bioloģiskajām zālēm ražotnes maiņa nav formalitāte un kāpēc regulatori pieprasa salīdzinošus pētījumus pat tad, ja gēns ir tas pats. Olbaltumvielas identitāti nosaka ne tikai tas, kas ir uzrakstīts gēnā, bet arī tas, kas ar molekulu notiek pēc tās sintēzes.