Kanamicīna rezistences gēns: kā darbojas marķieris

Šūnu transformācija ir ļoti neefektīvs process: no lielas šūnu masas svešo DNS uzņem tikai neliela daļa. Bez atlases metodes šīs retās šūnas atrast nebūtu iespējams.

Antibiotikas pievienošana barotnei atrisina šo uzdevumu vienā solī: visas šūnas bez plazmīdas iet bojā, un aug tikai tās, kurās gēns ir nonācis.

1. Plazmīdā tiek iekļauts gan pētāmais gēns, gan rezistences gēns.
2. Plazmīda tiek ievadīta baktērijās, augu vai zīdītāju šūnās.
3. Šūnas tiek pārnestas uz barotni, kas satur kanamicīnu vai tā radinieku.
4. Šūnas bez plazmīdas nespēj ražot olbaltumvielas un iet bojā.
5. Šūnas ar gēnu ražo fermentu, antibiotika tiek fosforilēta un kļūst nekaitīga.
6. Izaugušās kolonijas tiek pārbaudītas, vai tajās ir arī pētāmais gēns.

Kanamicīna rezistences gēns nav vienīgais šāda veida rīks. Katram marķierim ir sava antibiotika un savs darbības veids, un izvēle atkarīga no tā, kāda veida šūnās notiek darbs.

Iemesli ir praktiski. Ferments darbojas plašā temperatūras un skābuma diapazonā un neprasa nekādus retus palīgfaktorus, tikai adenozīntrifosfātu, kura šūnā vienmēr ir. Turklāt tas padara nedarbīgas vairākas radniecīgas antibiotikas, tāpēc vienu un to pašu gēnu var izmantot gan baktērijās, gan augu šūnās, gan zīdītāju šūnu kultūrās, tikai mainot izmantoto vielu.

Otrs iemesls ir atlases skaidrība. Aminoglikozīdi nogalina, nevis tikai aptur augšanu, tāpēc šūnas bez gēna neizdzīvo un rezultāts ir viennozīmīgs. Citiem marķieriem, kas augšanu tikai bremzē, fonā mēdz izaugt arī nevēlamas šūnas.

Trešais iemesls ir vēsturisks. Šis gēns bija viens no pirmajiem, kas tika iekļauts augu transformācijas sistēmās, un uz tā balstītas metodes kļuva par standartu daudzās laboratorijās.

Jāpiebilst, ka gēna klātbūtne pati par sevi šūnai neko nemaina. Lai ferments tiktu saražots, gēnam priekšā jābūt promotoram, kas darbojas konkrētajā šūnu tipā. Tieši tāpēc augu un zīdītāju šūnām paredzētajās plazmīdās to pašu baktēriju izcelsmes gēnu novieto aiz pavisam cita vadības elementa, un dažkārt tā nolasīšanas secība tiek pielāgota attiecīgā organisma iecienītajiem kodoniem.

Augu gēnu inženierijā rezistences gēnu izmanto, lai no tūkstošiem apstrādātu šūnu atlasītu tās retās, kurās jaunais gēns ir iestrādāts hromosomā. Pēc atlases pati rezistence augam vairs nav vajadzīga, taču gēns paliek augā un nonāk arī galaproduktā.

Sabiedrībā tas izraisījis diskusiju par divām iespējamām problēmām: vai gēns varētu pāriet zarnu baktērijām un vai tas varētu ietekmēt antibiotiku efektivitāti ārstēšanā. Eiropas pārtikas nekaitīguma iestāde šos jautājumus ir vērtējusi atkārtoti. Būtiski ir divi apsvērumi: attiecīgie gēni baktēriju vidē jau ir plaši izplatīti dabiski, un kanamicīna izmantošana cilvēku ārstēšanā mūsdienās ir ļoti ierobežota.

Neatkarīgi no vērtējuma nozare pati ir virzījusies uz marķieru izmantošanas samazināšanu. Tiek izmantotas metodes, kurās marķieri pēc atlases izgriež ar īpašu fermentu sistēmu, kā arī pieejas, kurās marķiera gēnu un pētāmo gēnu ievada atsevišķi un pēc tam atdala krustojot.

Praksē tas nozīmē, ka marķiera gēna klātbūtne kādā šķirnē nav pazīme par produkta nekaitīgumu vai kaitīgumu pati par sevi. Katrs ģenētiski modificēts produkts Eiropas Savienībā tiek vērtēts atsevišķi, un vērtējumā tiek skatīts gan ievadītais mērķa gēns, gan marķieris, gan iegūtā auga sastāvs kopumā.

Laboratorijā pati atlase jau ir pirmā pārbaude: ja šūna aug antibiotikas klātbūtnē, gēns tajā darbojas. Tomēr tas nepierāda, ka klāt ir arī vajadzīgais gēns, tāpēc seko papildu pārbaudes.

Pārtikas un vides kontroles laboratorijās ģenētiski modificēta materiāla noteikšanai izmanto polimerāzes ķēdes reakciju, kas atpazīst konkrētas DNS sekvences, tostarp marķiera gēnu. Olbaltumvielas līmenī fermentu var noteikt ar imūnķīmiskiem testiem. Sarežģītākos gadījumos izmanto pilnu ievadītā fragmenta sekvenēšanu.

• Augšana barotnē ar antibiotiku kā pirmā atlase.
• Polimerāzes ķēdes reakcija marķiera sekvences noteikšanai.
• Imūnķīmisks tests fermenta olbaltumvielas noteikšanai.
• Sekvenēšana, lai apstiprinātu ievadītā fragmenta uzbūvi.
• Kontroles paraugi, lai izslēgtu piesārņojumu.

Kanamicīns mūsdienās cilvēku ārstēšanā tiek lietots reti; to lielā mērā aizstājuši citi aminoglikozīdi ar labāku panesamību. Tomēr visai grupai ir kopīgas blakusparādības: tā var bojāt nieres un iekšējo ausi, un dzirdes vai līdzsvara traucējumi pēc šo zāļu lietošanas var būt neatgriezeniski.

Baktēriju rezistence pret aminoglikozīdiem klīnikā ir reāla problēma, un tās pamatā ir tie paši fermenti, kas laboratorijā kalpo par marķieriem. Rezistences noteikšanu veic mikrobioloģijas laboratorija, bet ārstēšanas izvēli nosaka infektologs vai ārstējošais ārsts atbilstoši jutības testam.

Pacientam praktiski svarīgākais ir zināt, ka antibiotiku kursu nedrīkst pārtraukt priekšlaicīgi vai lietot pēc saviem ieskatiem, jo tieši nepilnīga un nepamatota lietošana veicina rezistento celmu izplatību. Ja antibiotiku lietošanas laikā parādās troksnis ausīs, dzirdes pavājināšanās vai reibonis, par to nekavējoties jāpaziņo ārstam.

Pirmais sajaukums ir starp gēnu un plazmīdu. Plazmīda ir nesējs, gēns ir viens no tās saturiem; vienā plazmīdā var būt vairāki rezistences gēni.

Otrais sajaukums ir starp atlases marķieri un reportiergēnu. Marķieris nodrošina izdzīvošanu, reportiergēns padara šūnu redzamu, piemēram, liek tai spīdēt zaļganā krāsā vai nokrāsoties. Pirmais atsijā, otrais parāda.

Trešais sajaukums ir domāt, ka rezistences gēns padara šūnu izturīgu pret visām antibiotikām. Tas darbojas tikai pret konkrētu vielu grupu ar noteiktu ķīmisku uzbūvi, un pret citām grupām šūna paliek tikpat jutīga kā iepriekš.

• Gēns nav plazmīda, bet plazmīdas sastāvdaļa.
• Marķieris atlasa, reportiergēns padara redzamu.
• Izturība attiecas tikai uz konkrētu antibiotiku grupu.
• Ferments antibiotiku nesadala, bet pievieno tai fosfātu.
• Gēna klātbūtne pati par sevi neko neražo, ja tas netiek nolasīts.

Aminoglikozīdi darbojas tieši tāpēc, ka baktērijas ribosoma atšķiras no cilvēka šūnas ribosomas. Tomēr cilvēka mitohondrijos ir sava, baktērijām radniecīga ribosoma, un tieši tā ir vājā vieta. Daļai cilvēku mitohondriju gēnā ir iedzimts variants, kura dēļ šī ribosoma antibiotiku saista daudz ciešāk, un šādam cilvēkam pat parasta aminoglikozīda deva var izraisīt smagu, neatgriezenisku dzirdes zudumu.

Šāda uzņēmība tiek mantota pa mātes līniju, jo mitohondriji bērnam nonāk no olšūnas. Tāpēc dzimtās sastopams dzirdes zudums pēc antibiotiku lietošanas ir svarīga informācija, kas jāpasaka ārstam pirms šādu zāļu saņemšanas.

Šis piemērs labi parāda, cik cieši savijusies ir molekulārā bioloģija un klīnika. Viena un tā pati molekula laboratorijā ir atlases rīks, slimnīcā ir zāles, bet noteiktam cilvēkam var būt dzirdes zuduma cēlonis, un atšķirību nosaka tikai tas, kā tā mijiedarbojas ar konkrēto ribosomu.